摘要：本文以壶瓶碎米荠为原材料，研究碎米荠中蛋白质的提取最佳工艺，并测定碎米荠中蛋白质含量。使用NaOH溶液为提取液提取碎米荠中的蛋白质，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。研究了料液比、NaOH溶液浓度、提取时间、提取温度等因素对碎米荠蛋白质提取率的影响。在单因素试验的基础上，基于Box-Behnken的中心组合实验设计原理对碎米荠中蛋白质的进行了四因素三水平的响应面分析。利用响应面分析法对回归模型进行建立提取优化，该回归模型拟合情况良好。结果表明，对碎米荠中蛋白质提取率影响程度由大到小的顺序为料液比>NaOH溶液浓度>时间>温度。确定碎米荠中蛋白质的提取工艺的最佳工艺参数为：料液比为1:42g/mL，NaOH溶液浓度为0.108mol/L，提取时间为19分钟，提取温度为51℃，在此工艺条件下得到的碎米荠中蛋白质的提取率为33.96%。
关键词：碎米荠；蛋白质；响应面
1 绪论
壶瓶碎米荠最早于2000年5月在湖北省恩施州被吴永尧等人发现，但未正式发表，2008年由白宏峰等人将其作为湖南省壶瓶山地区特有的一种新品种发表于湖北农业科学杂志[1]。壶瓶碎米荠是一种富硒植物。大量研究证明，硒与人体健康密切相关，硒的适量补充能够有效的预防和治疗多种疾病。壶瓶碎米荠对环境中的硒有很强的耐受能力和富集能力，在富硒植物研究和硒产品的开发方面具有重要的研究意义。
1.1碎米荠简介
碎米荠为十字花科碎米荠属的一年生小草本植物，大多生长于山坡、路旁、荒地及耕地的草丛中，在我国分布广泛[2]。碎米荠可作野菜食用，同时也可供药用，具有清热去湿、止咳平喘等功效。
碎米荠中含有丰富蛋白质、维生素和多种人体所需的微量元素和矿物质，具有很高的食用价值。碎米荠作为一种富硒新物种，在富硒土壤（10–70mg/kgDW）中生长时，根茎中的硒含量可以高达4414mg/kg。壶瓶碎米荠（包括根、茎、叶）中70%以上的硒以硒代胱氨酸（SeCys2）的形式积累，且随着植物体内总硒浓度的增加而增加[3]。碎米荠能够较好的协调控制硒的吸收和耐受，将土壤中的无机硒如亚硒酸钠、硒酸钠转化为硒蛋白、硒多糖等[4]。
1.2碎米荠中主要生物活性成分
1.2.1硒和硒蛋白
硒是一种人体必需的微量元素，以硒代半胱氨酸（Sec）等形式参与人体内酶系统中谷胱甘肽过氧化物酶 （GPx）、硫氧还蛋白还原酶（TRxR）等的组成，具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等作用[5-7]，与人体生命代谢息息相关。人类多种疾病与硒的缺乏有关，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病等[8]。最早关于硒在心血管（CV）系统中的作用的研究可以追溯到克山病，这是一种在1980年以前发生在中国缺硒地区的充血性心肌病[9]。王春苗等[10]总结了硒及硒蛋白通过维持眼表微环境、降低氧化应激水平、作为抗原参与自身免疫等多种有效方式在眼表、眼底疾病和甲状腺相关眼病中发挥着重要的作用。Sun等[11]研究结果表明硒缺乏抑制了硒蛋白的表达，会削弱树突状细胞刺激混合同种异体淋巴细胞增殖的能力，从而抑制其分化和免疫功能。Alim等[12]研究了硒在阻断铁死亡和治疗中风中的作用，研究发现在出血性或缺血性中风后全身给予脑渗透剂硒肽可以激活稳态转录以抑制细胞死亡并改善功能，得出硒可以促进抗氧化剂GPX4的表达，保护神经元，有效地抑制了GPX4依赖性铁死亡以及由兴奋毒性或内质网应激诱导的细胞死亡的结论。
与硒缺乏相比，硒中毒的概率较低，大多是由于日常食物中硒含量较高而导致的长期过量摄入。硒作为人体不可或缺的微量元素，它对生物体产生有益作用的浓度与开始产生毒性作用的浓度之间的范围却很狭窄，因此在服用含硒的膳食补充剂的时候应当注意硒的安全限度和潜在的毒性作用[13]。每天摄入超过400μg的硒可导致脱发，肝坏死，脆弱的指甲疾病，脑水肿，肝损伤和神经毒性。肠胃不适、脱发、指甲白色斑点、呼吸中有大蒜味是硒中毒患者的常见症状[14]。急性硒过量的其他症状不具有特异性，如呕吐、头晕和肺水肿。Loomba等人[15]研究了中高硒暴露后血液化学的变化，结果表明长期接触高硒环境的人甲状腺激素水平、肝酶和胰腺酶均有异常改变。过去15年中实验和非实验性人体研究的累积证据表明，暴露于高水平的微量元素硒会增加患2型糖尿病的风险[16]。
环境中的硒多以硒化物（Se2-）、硒酸盐（SeO42-）和亚硒酸盐（SeO32-）等无机形式存在。这些形式通过微生物、植物、动物和人类的生物过程转化为有机硒，主要是硒代氨基酸硒代半胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸 （SeMet）。硒的生物利用度与两个因素相关，一个是硒的化学形式，另一个是硒的来源。有机硒是无机硒经过生物转化途径得到的，转化后硒的生物利用度、毒性、生理活性都得到了改善。人们通常是通过食用富含硒的植物和动物产品，特别是从植物中摄取硒来增加机体的硒摄入量。植物以硒酸盐的形式从土壤中吸收硒，然后将其转化为有机形式SeCys和SeMet存储在体内。可食用植物中的硒的含量主要取决于生长土壤中硒的浓度以及植物积累这种元素的能力。此外，其他因素如气候条件、pH值、有机质、盐度等也会影响[17]。富硒食品的生产有助于克服硒缺乏，改善人体健康。目前市面上比较常见的富硒食品有：富硒枸杞、富硒大米、富硒西兰花、富硒茶叶等。
硒的许多生物学功能是由硒蛋白完成的。硒作为第21种氨基酸——硒代半胱氨酸的一部分，由UGA密码子编码并入多肽链，任何在其多肽链中包含Sec的蛋白质都被定义为硒蛋白。目前发现人类有25种硒蛋白，其中大部分为硒代半胱氨酸残基在氧化还原调节和抗氧化活性中起催化作用的氧化还原酶。大量的研究显示，硒蛋白在氧化还原调节、抗氧化应激、减少炎症反应等方面起着巨大的作用。如谷胱甘肽过氧化物酶具有催化过氧化物保护机体免受氧化应激、缓解细胞凋亡、保护甲状腺免受甲状腺细胞中过氧化氢的影响等功能[18]；硒蛋白K是一种内质网跨膜蛋白，在调节内质网（ER）应激和抗氧化应激中起关键作用，限制ROS的产生从而防止过度自噬介导的降解和凋亡死亡[19]；硒蛋白P是人血浆中主要的含硒蛋白，主要在肝脏中合成。它的主要功能是参与硒的储存和运输，可以将硒转运到目标组织，在硒代谢和抗氧化防御中起关键作用[20]。目前，硒蛋白的的生理生化功能也成为社会上营养产品所关注的焦点。
1.2.2硒代氨基酸
氨基酸是蛋白质的组成成分，由人体能否自身合成分为非必需氨基酸和必需氨基酸两大类。含有机硒的氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）和硒代蛋氨酸（SeMet），既可以作为直接的抗氧化剂，又能充当硒的来源去合成硒蛋白。
碎米荠含有的硒代氨基酸主要为硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸[21]。硒代半胱氨酸由终止密码子UGA编码，被称为合成蛋白质的第21种氨基酸。硒代半胱氨酸被鉴定为GPx、TRxR和脱碘酶等几种硒蛋白的活性位点[22]。Kim等[23]以秀丽隐杆线虫为模型，研究了硒代半胱氨酸对环境压力和衰老的反应，研究结果表明硒代半胱氨酸能够增加线虫对环境压力的抵抗力并延长寿命。硒代蛋氨酸具有较高的生物利用度和低毒性，因此是一种受欢迎的膳食补充剂。作为蛋氨酸的硒类似物，硒代蛋氨酸可以非特异性地并入蛋白质中以代替蛋氨酸，从而使蛋白质作为硒代蛋氨酸的储存库，直至降解[24]。满云翔等[25]选用硒代蛋氨酸作为处理试剂研究其对小鼠巨噬细胞的影响，研究结果显示低浓度的硒代蛋氨酸能够显著促进小鼠巨噬细胞的增值，也能使硒蛋白K相应的增加以增强巨噬细胞的免疫能力。甲基硒代半胱氨酸被认为是对人类最有益的硒形式，其L构型被中国CFDA批准为食品营养强化剂，具有抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等多种作用[26]。它既能通过安全的无机硒途径组成多种硒蛋白，也能通过甲基化途径（抗癌活性形式甲基硒醇）发挥多种生理功能。Wang等[27]使用转基因腺癌小鼠前列腺（TRAMP）模型来建立甲基亚硒酸和甲基硒代半胱氨酸对前列腺癌的疗效，得出硒化合物MSeA和MSeC可抑制早期前列腺癌的发生的结论。
1.2.3其它生物活性成分
碎米荠中的生物活性成分除硒蛋白、硒代氨基酸外，还有硒多糖、含硒黄酮等。
多糖普遍存在于自然界植物体中，是由细胞代谢产生的天然大分子化合物。硒多糖是一种新型的功能性多糖，它将无机硒与多糖结合，形成有机硒产品。硒多糖具备硒和多糖两者的活性，同时相比无机硒和多糖更加安全、生物活性更高，利于人体吸收利用[28]。硒多糖可以起到抗重金属中毒、抗病毒、免疫调节等作用[29-31]。石爱华等[32]使用80%乙醇加热回流提取堇叶碎米荠中的多糖，测得其水溶性多糖含量为28.09mg/g。赵利霞[33]采用离子交换层析分离水提、醇沉法制备的华中碎米荠根中的硒多糖，得到四种成分单一的硒多糖。
多酚是生物活性分子中数量最多、分布最广的一类。多酚有两大类，一类是类黄酮，另一类是酚酸。作为一种抗氧化剂，多酚的保健作用得到了广泛认可。黄酮类化合物也称类黄酮，是多酚类次生代谢产物，具有多种生物活性，包括抗炎、抗癌、缓解神经退行性认知和记忆障碍、抗衰老等[34-35]。张春燕等[36]对壶瓶碎米荠粗黄酮的抗氧化性能展开研究，分别提取了普通种植和外源硒栽培的壶瓶碎米荠中的粗黄酮。其结果表明，施加硒肥的壶瓶碎米荠中的含硒粗黄酮的抗氧化能力和硒含量显著高于未加硒肥的壶瓶碎米荠中的粗黄酮，硒能够与黄酮相结合并提升黄酮的抗氧化能力。
1.3碎米荠中蛋白质提取的研究进展
植物蛋白质具有抗氧化、抗炎、增强免疫力等功能。蛋白质的提取是研究硒蛋白性质的前提，常用的提取方法为溶剂提取法，同时辅以搅拌、超声或冻融等[37]。根据蛋白质溶解性的差异，常用的提取试剂有水、碱、盐、醇等。碎米荠中的蛋白质以碱溶蛋白质和水溶性蛋白质为主[38]。用氢氧化钠碱提是从各种基质中回收蛋白质分离物的最广泛使用的方法，它通过破坏细胞壁的方式使提取蛋白质更容易，碱提之后通常是通过添加稀酸进行沉淀[39-40]。通过碱溶酸沉法提取能获得大量的可溶性蛋白，Osborne法提取的蛋白虽然含量较低但获得的种类较多[41]。Osborne分离法使用不同的溶剂连续提取样品中的蛋白质，其原理是根据各种蛋白质在不同溶剂中溶解性的差异，将可溶性蛋白与不溶性蛋白进行分离[42]。
近年来对于各种富硒植物的研究众多。李宝瑞等[43]以富硒黄豆为提取原材料，选择了pH=7.2的磷酸缓冲液为浸提液，在研究提取工艺的同时得出土壤硒含量的增加可以促进硒蛋白合成的结论。梁潘霞等[44]对富硒大米中的硒蛋白提取方法进行研究，在0.1mol/LNaCl溶液、NaOH溶液、盐酸溶液和水中选取最佳提取溶剂，然后采用单因素试验和L9（34）正交试验设计优化提取条件。彭炜[45]分别采用超声波辅助碱法和双酶法提取富硒平菇中硒蛋白，通过正交试验优化得到最佳提取条件，硒蛋白提取率分别为41.68%和51.65%。陈雪青[46]参考Osborne分级法顺序提取了富硒绿茶中的四种蛋白质组分。通过分析显示富硒绿茶中的有机硒约7成是硒蛋白，水溶性和碱溶性蛋白占主要。
贾蕾等[47]在对碎米荠硒肽的制备及其体外抗氧化活性展开研究的过程中，以恩施碎米荠为原材料，利用碱溶酸沉法浸提碎米荠蛋白。单因素试验得到的碎米荠蛋白提取的最优条件为：提取溶液0.1mol/LNaOH、液料比45：1mL/g、提取温度60℃、提取时间3h、提取2次，此时碎米荠蛋白的提取率为72.91%。Zhu等[48]通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解法从堇叶碎米荠中提取了富硒肽（SPE），然后通过超滤分离筛选出抗氧化活性最高的4个超滤膜SPE组分，并通过LC-MS/MS对其氨基酸序列进行了鉴定。Wu等人[49]以水为溶剂，比较了常规提取法（CE）、超声辅助提取法（UAE）、脉冲电预处理后CE（PEF+CE）和脉冲电预处理后UAE（PEF+UAE）提取蛋白的效果。这四种方法中UAE的效果最好，在最佳条件下硒蛋白提取率可达57.35%。李瑜等[50]选择堇叶碎米荠作为研究对象，通过使用去离子水、pH=8.5的磷酸盐缓冲液、稀盐、乙醇和稀碱等不同提取液分别提取堇叶碎米荠中的无机硒和有机硒，采用双道原子荧光光度计检测硒含量指标。研究结果显示高硒堇叶碎米荠中硒蛋白是有机硒的第二大存在形式，其中水溶性蛋白硒含量占总硒量的四成。综上所述，碎米荠中蛋白质的提取集中在以水和稀碱为提取溶剂提取硒蛋白，但存在单独使用提取效率低、提取时间较长等问题，在提高碎米荠蛋白质提取率、提取出的蛋白质纯度等方面需进一步深入研究。
1.3研究内容及意义
1.4.1研究内容
本课题以壶瓶碎米荠为原料，采用碱提法对其进行了蛋白质的提取，确定提取纯化壶瓶碎米荠中蛋白质的最佳工艺，完成并测定碎米荠中蛋白质含量。通过单因素试验得到料液比、NaOH溶液浓度、提取时间、提取温度这四个影响蛋白质提取率因素的最佳条件，并以此为依据，对蛋白质提取进行响应面分析从而确定碎米荠蛋白质的最佳提取工艺。
1.4.2研究意义
壶瓶碎米荠是一种硒超富集植物，硒蛋白是有机硒在植物体内的主要存在方式之一。开展对壶瓶碎米荠中蛋白质的提取分析研究，对后续的关于硒蛋白的分离纯化和硒蛋白结构、性质及生物学功能的研究和开发等方面有着重要意义，为进一步评价该富硒植物的营养价值、补硒效果、生产补硒产品提供了非常有价值的基础数据和分析方法。
2 材料与试验方法
2.1实验材料与仪器
2.1.1.主要仪器设备
表1 主要仪器设备
| 名称 | 型号 | 公司 |
| 紫外可见分光光度计 | UV 5800PC | 上海元析仪器有限公司 |
| 台式自动离心机 | Feb-80 | 常州国华电器有限公司 |
| FA2004型电子天平 | FA2004 | 上海越平科学仪器有限公司 |
| 超声波清洗机 | PS-D40A | 东莞市洁康超声波设备有限公司 |
| 石英荧光微量比色皿 | 无锡市晶禾光学仪器有限公司 |
其他仪器均为常规。
2.1.2实验材料与试剂
表2 实验材料与试剂
| 名称 | 规格 | 厂家 |
| 无水乙醇 | 分析纯AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 磷酸 | 分析纯AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 考马斯亮蓝G-250 | 显微镜用FMP | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 牛血清白蛋白 | ≥98% | 广州赛国生物科技有限公司 |
| 氢氧化钠 | 分析纯AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 壶瓶碎米荠 | 湖北恩施农科所 |
2.2试验方法
2.2.1壶瓶碎米荠中蛋白质的提取
在50mL烧杯中称取一定量的碎米荠粉末，按照一定的料液比加入浓度为0.100mol/L的NaOH溶液。用玻璃棒混合均匀，烧杯中无成团的碎米荠时停止搅拌，在常温下超声辅助提取一定时间。选取适当的离心管，倒入烧杯中的液体，在4000r/min的转速下离心20分钟，将上清液分离，并测定蛋白质的含量。
2.2.2蛋白质含量的测定及标准曲线
采用考马斯亮蓝法测定了碎米荠中的蛋白质，并选用了牛血清白蛋白配制标准蛋白质溶液。考马斯亮蓝法是一种蛋白质含量检测方法，目前在实验室中广泛使用。其特点是所需的样品量少、染料结合稳定、灵敏度高、测定速度快、干扰物质少[51]。
称取100mg考马斯亮蓝G-250，加入50mL的无水乙醇将其溶解，然后取100mL85%磷酸加入其中，转移到规格为1000mL容量瓶内，用蒸馏水稀释定容至1000mL，过滤后使用。
称取250mg牛血清白蛋白，用少量的蒸馏水溶解，转移至规格为250mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至250mL，完成浓度为1mg/mL的标准蛋白质溶液的配制。
选取6支试管，将配置好的标准蛋白质溶液按照0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL的次序先后加入各试管内，再补加蒸馏水至1mL。每支试管中加入5.0mL考马斯亮蓝试剂，充分摇匀并静置，静置时间为5min。通过紫外分光光度计在595nm下完成溶液吸光度的测定工作。蛋白质标准曲线的绘制中，选取的横坐标是蛋白质溶液浓度，纵坐标是吸光度（A595）。
得到的蛋白质标准曲线如图2所示，该标准曲线在0-100μg/mL浓度范围内线性关系良好。回归方程如下：
式中，Y是指测量样品在595nm下的吸光度值；X是指测量样品中的蛋白质浓度，单位为μg/mL。
蛋白质含量的测定：在试管中加入0.9mL去离子水，取0.1mL提取液离心后得到的上清液加入其中，再加入5.0mL考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，采用和标准曲线相同的方法测定。测出的吸光度代入回归方程，溶液中的蛋白质浓度即可得出。
壶瓶碎米荠中蛋白质提取率按公式2.2计算：
式中，n表示稀释倍数，M表示M为由所测吸光度值计算所得的蛋白质质量，单位为g；V表示测量时的体积，单位为mL；m为提取所称量的壶瓶碎米荠的质量，单位为g。
2.2.3壶瓶碎米荠中蛋白质提取工艺的优化
2.2.3.1壶瓶碎米荠中蛋白质提取工艺的单因素试验
用NaOH溶液从壶瓶碎米荠中提取蛋白，分别以料液比、NaOH溶液浓度、超声时间和提取温度为单因素进行单因素试验，探讨了不同条件对提取效果的影响。
在NaOH溶液浓度、超声时间、提取温度相同的情况下，分别按料液比1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70g/mL将碎米荠粉末和NaOH溶液混合均匀，超声辅助提取蛋白质。用考马斯亮蓝法测量所得的吸光度值计算出蛋白质提取率，确定最佳提取料液比。
在料液比、超声时间、提取温度相同的情况下，分别将碎米荠粉末与0.025mol/L、0.050mol/L、0.075mol/L、0.100mol/L、0.125mol/L、0.150mol/L、0.175mol/L的NaOH溶液混合，超声辅助提取蛋白质。用考马斯亮蓝法测量所得的吸光度值计算出蛋白质提取率，确定最佳NaOH溶液浓度。
在料液比、NaOH溶液浓度、提取温度相同的情况下，将碎米荠粉末和NaOH溶液混合，分别超声辅助提取5min、10min、15min、20min、25min、30min。用考马斯亮蓝法测量所得的吸光度值计算出蛋白质提取率，确定最佳提取时间。
在料液比、NaOH溶液浓度、超声时间相同的情况下，将碎米荠粉末和NaOH溶液混合，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下超声辅助提取蛋白质。用考马斯亮蓝法测量所得的吸光度值计算出蛋白质提取率，确定最佳提取温度。
2.2.3.2响应面实验设计
在单因素试验结果的基础之上，利用Design Expert.V.8.0.6软件设计了4因素3水平的响应面分析实验，其设计原理为Box-Behnken设计原理。实验选取的因素和水平见表3.
表3 响应面实验因素水平表
| 因素 | 水平 | ||
| -1 | 0 | 1 | |
| A料液比 | 30 | 40 | 50 |
| B NaOH溶液浓度 | 0.075 | 0.1 | 0.125 |
| C时间 | 15 | 20 | 25 |
| D温度 | 45 | 50 | 55 |
3结果与讨论
3.1壶瓶碎米荠中蛋白质提取工艺的单因素试验
3.1.1料液比对壶瓶碎米荠蛋白质提取率的影响
如图3所示，随着料液比的提高，壶瓶碎米荠中蛋白质的提取率逐渐上升。在料液比较低时（1:10-1:40g/mL范围内），蛋白质提取率随料液比的增加而增长迅速。原因可能是料液比较小，提取溶剂黏度高，对蛋白质的扩散作用不利，从而导致溶出速度慢。同时，由于料液比小，造成溶出的蛋白质分子之间的斥力增加，也对蛋白质的溶出不利。随料液比例的增加，提取溶剂的黏度降低，蛋白分子间的排斥作用降低，从而提高了壶瓶碎米荠的蛋白质提取率。壶瓶碎米荠中的蛋白质提取率在料液比为1：40g/mL之后增加的趋势变缓，可能是因为蛋白质的溶出趋近于平衡，增加料液比对提高蛋白质提取率作用不明显。因此在综合考虑下选择料液比1：40（g/mL）作为壶瓶碎米荠中蛋白质提取的最佳条件。
3.1.2NaOH溶液浓度对壶瓶碎米荠蛋白质提取率的影响
如图4所示，随着NaOH溶液浓度的增加，壶瓶碎米荠中蛋白质的提取率逐渐增大。这可能是由于蛋白质被水解后末端羧基与末端氨基增多，增加了蛋白质的亲水性。当NaOH溶液浓度达到0.100mol/L后，提取率增加相对变缓，可能是NaOH溶液浓度增大使部分氨基酸被破坏。因此在综合考虑下选择0.100mol/L的NaOH溶液浓度作为壶瓶碎米荠中蛋白质提取的最佳条件。
3.1.3提取时间对壶瓶碎米荠蛋白质提取率的影响
如图5所示，随着超声提取时间的延长，壶瓶碎米荠中蛋白质的提取率先增大，20min时达到峰值，接着蛋白质提取率随时间增加而减小。这可能是是由于蛋白质吸附溶剂分子，体积膨胀使蛋白质溶出困难。提取时间的增加，也使得碎米荠中的其他物质溶于溶剂中，从而导致溶液中蛋白质含量的降低。因此，最佳的提取时间为20分钟。
3.1.4提取温度对壶瓶碎米荠蛋白质提取率的影响
如图6所示，壶瓶碎米荠中蛋白质的提取率随着提取温度的升高呈现先增加后减小的趋势。在30-50℃范围内，温度的升高使蛋白质的结构得以伸展，更有利于蛋白质与水分子相互作用，蛋白质提取率逐渐增大。而且随温度的增加，分子的热运动也会增强。在50℃之后提取率又随着温度的升高而降低，可能是随着温度的继续升高，蛋白质变性，空间结构被破坏，导致蛋白质的溶解度降低。所以，壶瓶碎米荠蛋白质提取的最佳温度应为50℃。
3.2响应面分析法优化壶瓶碎米荠蛋白质提取工艺
响应面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）是通过响应函数对理论设计中所研究的实验领域进行数学拟合的技术方法，在实验设计、数据分析等方面具有较好的应用。它通过合理的实验设计结果得出二次多项式模型，模型用于拟合影响因素及其之间的交互作用与响应值之间的关系。
3.2.1响应面实验结果
本试验采用响应面分析法来确定壶瓶碎米荠蛋白质提取的最佳工艺条件。利用DesignExpert.V.8.0.6软件设计出4因素3水平共29组实验，实验设计和结果见表3.1所示。
表4 4因素3水平响应面分析法实验设计和结果
| 编号 | A液料比 | B NaOH浓度/mol·L-1 | C时间/min | D温度/℃ | 提取率/% |
| 1 | 40.00 | 0.100 | 20.00 | 50.00 | 32.60 |
| 2 | 40.00 | 0.100 | 15.00 | 55.00 | 29.21 |
| 3 | 30.00 | 0.075 | 20.00 | 50.00 | 17.19 |
| 4 | 50.00 | 0.100 | 20.00 | 55.00 | 27.98 |
| 5 | 40.00 | 0.125 | 15.00 | 50.00 | 30.77 |
| 6 | 40.00 | 0.075 | 20.00 | 45.00 | 23.25 |
| 7 | 40.00 | 0.100 | 20.00 | 50.00 | 33.51 |
| 8 | 30.00 | 0.100 | 25.00 | 50.00 | 20.98 |
| 9 | 30.00 | 0.100 | 20.00 | 55.00 | 21.51 |
| 10 | 40.00 | 0.075 | 25.00 | 50.00 | 23.23 |
| 11 | 40.00 | 0.100 | 15.00 | 45.00 | 25.05 |
| 12 | 40.00 | 0.125 | 25.00 | 50.00 | 26.72 |
| 13 | 40.00 | 0.075 | 15.00 | 50.00 | 25.19 |
| 14 | 50.00 | 0.100 | 15.00 | 50.00 | 28.29 |
续表4 4因素3水平响应面分析法实验设计和结果
| 编号 | A液料比 | B NaOH浓度/mol·L-1 | C时间/min | D温度/℃ | 提取率/% |
| 15 | 30.00 | 0.100 | 20.00 | 45.00 | 19.54 |
| 16 | 40.00 | 0.125 | 20.00 | 55.00 | 30.12 |
| 17 | 40.00 | 0.100 | 25.00 | 55.00 | 24.65 |
| 18 | 40.00 | 0.100 | 20.00 | 50.00 | 33.09 |
| 19 | 40.00 | 0.100 | 20.00 | 50.00 | 32.91 |
| 20 | 40.00 | 0.075 | 20.00 | 55.00 | 22.77 |
| 21 | 30.00 | 0.125 | 20.00 | 50.00 | 25.65 |
| 22 | 40.00 | 0.125 | 20.00 | 45.00 | 24.03 |
| 23 | 50.00 | 0.125 | 20.00 | 50.00 | 26.05 |
| 24 | 40.00 | 0.100 | 20.00 | 50.00 | 32.76 |
| 25 | 50.00 | 0.100 | 25.00 | 50.00 | 25.70 |
| 26 | 50.00 | 0.100 | 20.00 | 45.00 | 23.52 |
| 27 | 30.00 | 0.100 | 15.00 | 50.00 | 23.95 |
| 28 | 40.00 | 0.100 | 25.00 | 45.00 | 22.73 |
| 29 | 50.00 | 0.075 | 20.00 | 50.00 | 26.72 |
3.2.2响应面模型的建立
在Design Expert.V.8.0.6软件中进行回归分析，得到碎米荠蛋白质提取率的回归方程为：
式中，A是液料比，B是NaOH溶液浓度，C是提取时间，D是提取温度。
建立碎米荠中的蛋白质提取的响应面二次方模型并进行方差分析，结果如表5所示。
表5 回归方程模型方差分析表
| 来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 522.90 | 14 | 37.35 | 383.68 | ＜0.0001 | ** |
续表5 回归方程模型方差分析表
| 来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
| A液料比 | 75.14 | 1 | 75.14 | 771.85 | ＜0.0001 | ** |
| BNaOH溶液浓度 | 52.06 | 1 | 52.06 | 534.76 | ＜0.0001 | ** |
| C时间 | 30.24 | 1 | 30.24 | 310.67 | ＜0.0001 | ** |
| D温度 | 27.36 | 1 | 27.36 | 281.09 | ＜0.0001 | ** |
| AB | 20.84 | 1 | 20.84 | 214.12 | ＜0.0001 | ** |
| AC | 0.013 | 1 | 0.013 | 0.13 | 0.7243 | 不显著 |
| AD | 1.56 | 1 | 1.56 | 16.00 | 0.0013 | * |
| BC | 1.08 | 1 | 1.08 | 11.12 | 0.0049 | * |
| BD | 10.78 | 1 | 10.78 | 110.74 | ＜0.0001 | ** |
| CD | 1.25 | 1 | 1.25 | 12.82 | 0.0030 | * |
| A2 | 184.52 | 1 | 184.52 | 1895.52 | ＜0.0001 | ** |
| B2 | 83.25 | 1 | 83.25 | 855.18 | ＜0.0001 | ** |
| C2 | 54.90 | 1 | 54.90 | 563.97 | ＜0.0001 | ** |
| D2 | 131.27 | 1 | 131.27 | 1348.53 | ＜0.0001 | ** |
| 残差 | 1.36 | 14 | 0.097 | |||
| 失拟项 | 0.88 | 10 | 0.088 | 0.72 | 0.6923 | 不显著 |
| 纯误差 | 0.49 | 4 | 0.12 | |||
| 总和 | 524.26 | 28 |
注：P<0.05， 差异显著(*)；P<0.001差异极显著(**)；P>0.05，差异不显著
P值的大小反应了显著性水平。P<0.05则说明该模型或因素有显著影响，P<0.001则说明该模型或因素有极显著影响。本试验所得出的回归模型极显著（P<0.001），失拟项P=0.6923>0.05不显著，表明拟合出的回归方程具有合理性，可以使用此方程分析碎米荠蛋白质的提取工艺。该模型方程的相关系数R2=0.9974，表明该模型的拟合情况良好，99.74%的变化可以用这个模型来解释。变异系数是对模型再现性的衡量，一般来说，如果CV不大于10%，则可以认为模型具有合理的可重复性。方差分析结果中CV=1.2%，表明预测值有很好的精密度和可信度，方程能较好反映真实实验值。
由表5中的P值可知，除了料液比和时间的交互作用（AC）对蛋白质提取率的影响无显著性外，其余各因素、因素之间的交互项、二次项对蛋白质提取率都有显著影响。比较公式3.1各因素的回归系数绝对值大小，可以得到对提取率影响顺序依次为A（液料比）>B（NaOH溶液浓度）>C（时间）>D（温度）。
4总结与展望
本文以壶瓶碎米荠为原材料，研究碎米荠中蛋白质的提取最佳工艺，并测定碎米荠中蛋白质含量。
以壶瓶碎米荠为提取蛋白质的原材料，NaOH溶液为提取试剂，采用超声辅助法提取壶瓶碎米荠中的蛋白质，考察了不同料液比、NaOH溶液浓度、时间和温度对蛋白质提取率的影响。在单因素试验的基础上，对蛋白质的提取进行了四因素三水平响应面分析。影响程度大小顺序为：料液比>NaOH溶液浓度>时间>温度，利用响应面分析法对回归模型进行建立优化，最终确定碎米荠中蛋白质的最佳提取条件为：料液比为1：42g/mL，NaOH溶液浓度为0.108mol/L，提取时间为19分钟，提取温度为51℃。在此条件下得到的壶瓶碎米荠蛋白质提取率为33.96%。响应面模型的预测结果和实验值差距较小，故采用该响应面获得的最佳工艺参数是精确、可靠的，具有实际应用价值。
壶瓶碎米荠作为一种极具富硒能力的植物，硒蛋白是有机硒在其体内的主要存在方式之一，具有很高的研究和开发价值。目前国内外文献所介绍的蛋白质提取方法主要是用水、稀碱、缓冲溶液、盐溶液等溶剂提取。碱提法提取碎米荠中的蛋白质提取率较高、操作简便、成本也较低廉，是提取植物中的蛋白质较为常用的方法。用碱提法提取蛋白质时使用超声波、微波或酶等方法辅助，可以提高蛋白质的提取率。优化碎米荠蛋白质提取工艺可以有效提高碎米荠蛋白质的提取效率，为研究碎米荠的营养价值、开发新的补硒产品等方面提供帮助。
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